Plos Biology | 汤富酬课题组与乔杰课题组合作绘制人类视网膜高精度发育细胞图谱
人类胚胎发育从受精卵开始，经过着床前胚胎发育（胚内和胚外组织的产生），原肠胚产生（三胚层的特化）和器官发生等阶段，最终新生儿出生。人类胚胎发育从单个细胞到上万亿个细胞，历时二百八十天，整个过程的基因表达受到多种因素的精细调控，其中很多机制尚未明确。
为了解析人类胚胎发育各个阶段的基因表达调控网络，自2010年起，北京大学未来基因诊断高精尖创新中心汤富酬课题组和北医三院乔杰课题组就开始紧密合作，围绕人类生殖系细胞（包括着床前胚胎细胞和着床后胚胎生殖细胞）发育的基因表达调控机制系统地开展研究工作（如图1所示）。
首先，应用汤富酬课题组发展的单细胞转录组高通量测序技术，汤富酬课题组和乔杰课题组绘制了完整的人类生殖系细胞的发育细胞图谱，包括着床前胚胎的发育细胞图谱（Yan et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2013; Dang et al., Genome Biology, 2016)和着床后胚胎生殖细胞的发育细胞图谱（Guo et al., Cell, 2015;Li et al., Cell Stem Cell, 2017），并对其DNA甲基化、染色质状态等不同层面的表观遗传学调控机制进行了深入的研究（Guo et al., Nature, 2014; Guo et al., Cell Research, 2017; Zhu et al., Nature Genetics, 2018; Li et al., Nature Cell Biology, 2018）。这两个团队还与南方医科大学赵小阳课题组合作完成了人类成年男性精子发生过程中的细胞命运转变和基因表达图谱的绘制（Wang et al.,Cell Stem Cell, 2018）。
图1. 汤富酬课题组和乔杰课题组合作项目概览
此后，两个团队全面展开对人类生殖系细胞以及非生殖系的各种重要器官的发育细胞图谱的研究，最终目标是绘制出人类胚胎发育所有重要阶段、所有主要器官系统的高精度发育细胞图谱。2018年，他们与中科院生物物理所王晓群课题组等合作，绘制了首个来自外胚层的人脑前额叶发育的单细胞图谱，揭示了神经元分化的成熟机制（Zhong et al., Nature, 2018）。他们还对人类胚胎大脑皮层的所有主要脑区进行了单细胞转录组研究，揭示了大脑皮层的区域化基因表达和神经元成熟的重要特征（Fan et al., Cell Research, 2018）。上述工作为绘制完整的人脑发育细胞图谱奠定了重要的基础。与此同时，对来自内胚层的消化道四种主要器官（食道、胃、小肠和大肠），两个团队研究了它们在人类胚胎发育过程中的基因表达图谱及其信号调控机制，进一步解析了从胎儿到成年大肠的发育、成熟路径和关键生物学特征 （Gao et al., Nature Cell Biology, 2018）。另外，这两个团队还合作开展了对来自中胚层的肾脏和心脏的发育细胞图谱研究。对于肾脏，他们深入研究了完整肾单位的细胞分化发育过程，阐释了由肾单位前体细胞逐步分化产生不同类型的肾小管上皮细胞过程中对应的转录调控事件和信号通路调节机制（Wang et al., Cell Reports, 2018）。对于心脏，他们揭示了心脏发育过程中关键信号通路的时空特异性激活特征以及心肌细胞与非心肌细胞之间的复杂信号互作机制，为心脏再生的研究提供了重要线索（Cui et al., Cell Reports, 2018）。
2019年 7月3日，人类主要器官发育图谱又添新作，汤富酬课题组与乔杰课题组在《Plos Biology》杂志上在线发表了题为“Dissecting the transcriptome landscape of the human fetal neural retina and retinal pigment epithelium by single-cell RNA-seq analysis”（通过单细胞转录组分析解析人类胚胎视网膜神经层和色素上皮层的转录组图谱）的研究成果，对来自外胚层的视网膜进行了深入的发育细胞图谱研究。
眼睛是心灵的窗户，而视网膜可以将外界的光转化为神经信号，是眼睛实现感光功能非常重要的组成部分。视网膜内层是神经层（主要包含视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、神经节细胞和缪勒细胞等），外层是色素上皮层（如图2所示）。目前，已有大量的基于小鼠模型的研究揭示了视网膜神经层和色素层的发育路线。但是，人类视网膜神经层和色素层发育的分子机制以及这两层结构中的细胞间的相互作用关系尚未明确。该课题组对来自人类胚胎5周到24周的视网膜神经层和色素上皮层（RPE）的2400多个细胞进行了高精度单细胞转录组测序分析。主要发现有：
图2. 人类视网膜神经层和色素上皮层的示意图
1. 揭示了人类胚胎视网膜的关键时空发育特征
该研究对视网膜神经层和色素上皮层分别取样，转录组分析（如图3所示）显示神经层特异表达神经系统发育相关的基因，而色素层特异表达的基因与视黄醇代谢相关。随着胚胎的发育，这两种组织都经历了由早期的细胞增殖高度活跃的状态到视觉感知逐渐成熟的状态。发育后期两者都参与视网膜的视觉感知，暗示了它们在发育后期可能存在功能上的相互作用。
图3. 视网膜神经细胞和色素上皮细胞的转录组特征
该研究鉴定出了各个类群对应的细胞类型（如图4所示），描绘了各个细胞类型的转录组图谱，并且揭示了体内发育过程中各种主要的视网膜神经细胞发生的准确时间。例如，在人类胚胎发育的第5周，视神经节细胞已经出现，并在第8周时细胞密度达到峰值。在胚胎第7周的时候可以检测到水平细胞，在胚胎第9周，这种细胞的密度达到峰值。随后，无长突细胞，光感受器细胞和缪勒细胞等相继出现。
图4. 人类胚胎视网膜的主要细胞类型和细胞发生时序
2．揭示了参与视网膜发育的细胞类型特异的转录因子及其靶标基因
视网膜发育研究的一个重要生物学问题是受转录因子调控的细胞命运决定的机制研究。该研究提供了一个关键的转录因子图谱。这些转录因子在视网膜神经细胞和色素上皮细胞中高度活跃，并且它们的靶标基因参与了视网膜发育的重要事件（如图5所示）。例如，转录因子RAX2主要在光感受器细胞中活跃，随着视网膜的发育，有一部分RAX2靶标基因的表达上调，这些基因参与了视觉感知和光刺激的检测，这与光感受器细胞的功能相符。MITF只在色素上皮细胞中有很高的活性，它的靶标基因在早期参与氨基酸的转运和神经管的闭合，晚期参与阳离子的转运。整个发育过程中，有一部分MITF的靶标基因持续表达，这些基因参与色素沉淀和细胞动力的调控。MITF靶标基因参与的上述事件都与视网膜色素上皮细胞的功能吻合。
图5. 细胞类型特异的转录因子及其靶标基因参与的发育事件
3．揭示了RPE细胞与光感受器细胞的重要相互作用
该研究提供了RPE细胞与光感受细胞相互作用的诸多线索（如图6所示）。成体的视网膜中，RPE细胞与光感受器细胞共同参与视循环-光转导通路。有报道称光转导始于视紫红质吸收光子。在人类胚胎发育过程中，直到第24周，光感受器细胞中才第一次检测到视紫红质基因的表达。然而在视网膜色素细胞中，第13周的时候就可以检测到一系列与视循环相关基因的表达。上述结果说明，胚胎发育的第13周，视网膜已经开始视循环，远远早于光转导的发生。该研究还检测到了成对的受体与配体基因在RPE细胞和光感受器细胞中的表达，这也为研究两种细胞的相互作用提供了重要线索。
图6. RPE细胞与光感受器细胞的相互作用
4．揭示了视觉相关疾病潜在靶点基因在发育过程中的时空特异性表达特征
该研究绘制了胚胎时期视网膜细胞中遗传疾病相关基因的表达谱。研究结果显示大部分疾病相关的基因在光感受器细胞，双极细胞和色素上皮细胞中富集。有报道显示，在中国人群中，USH2A, EYS和CRB1是导致遗传性视网膜营养不良贡献最大的三个基因。而在人类胚胎的视网膜中，USH2A主要在光感受器细胞中表达，EYS在双极细胞和光感受器细胞中高表达，CRB1在缪勒细胞和视网膜前体细胞中富集。视网膜前体细胞是对视网膜形成至关重要的细胞类群，该研究发现它还高表达CLRN1, KCNJ13和KIF11 等基因，视网膜遗传性疾病相关的基因在视网膜前体细胞中的突变可能是研究疾病发展的重要线索。
总之，该研究绘制了高精度的人类视网膜单细胞转录组图谱，解析了细胞类型特异的转录因子及其靶标基因参与的发育事件，探索了视网膜神经层与视网膜色素层在发育时期相互作用的方式，同时该研究还绘制了胚胎时期视网膜细胞的遗传疾病相关基因的表达谱。这项成果为人类视网膜发育的功能性研究和视网膜遗传性疾病的研究提供了重要线索。
北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心、生命科学学院博士后胡玉琼，北医三院王晓晔，北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心博士胡博强、博士生毛雨诺和陈依东为该论文的并列第一作者，汤富酬教授和乔杰教授为该论文的共同通讯作者。该项工作得到了国家重大科学研究计划、国家自然科学基金委、未来基因诊断高精尖创新中心以及生命科学联合中心（CLS）等的支持。
原文链接： https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000365