汤富酬组发表单细胞表观多组学测序技术的最新研究成果

2017年6月16日，北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心汤富酬课题组在《Cell Research》杂志在线发表了题为“Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells”的研究论文。在国际上率先发展了对一个单细胞同时进行染色质状态、DNA甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性的全基因组测序技术（single-cell COOL-seq），并采用这一技术在单细胞分辨率上系统、深入地解析了小鼠着床前胚胎发育过程中表观基因组重编程的关键特征，以及染色质状态与DNA甲基化之间的互动关系。

现有的基于高通量测序来分析全基因组染色质状态的研究方法通常需要大量细胞（例如ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq等）。即使这些方法可以做到单细胞分辨率，也无法在单细胞分辨率上对多种组学之间的互动关系进行研究。而汤富酬课题组将NOMe-seq（全基因组核小体定位及DNA甲基化组测序）技术和PBAT-seq技术（全基因组重亚硫酸盐测序）巧妙地结合起来（图1），并进行了系统的优化和提高，实现了对同一个单细胞进行多达5个层面的基因组和表观基因组特征的分析。

图1: single-cell COOL-seq原理图

该课题组利用这一新建立的scCOOL-seq方法，在单细胞分辨率系统地描绘了小鼠着床前胚胎发育过程中表观基因组多个层面的动态变化。该项研究发现：

（1）受精后12小时以内，来自高度特化的卵细胞和精子的雌雄原核就经历了大规模的基因组去甲基化。在此过程中，父母源基因组的染色体状态迅速打开，在受精卵的原核期就已经达到高度开放的状态，随后在受精卵晚期染色质开放程度大幅度回落，并在2-细胞阶段之后开放程度再次逐步增加，到囊胚期时达到最高点（图2）。

图2：小鼠着床前胚胎发育过程中基因组内源DNA甲基化（A）与染色质状态（B）以及染色质状态异质性（基因启动子区域；Homogeneously open、Divergent、Homogeneously closed三种异质性状态）（C）（D）的动态变化

（2）首次在单细胞分辨率系统分析了小鼠着床前胚胎发育过程中染色质状态的异质性。该研究发现在受精后12个小时以内受精卵中大部分基因的启动子区域就由均匀关闭状态迅速重编程为均匀开放状态，为合子基因在随后的转录做好准备（图2）。

（3）首次在单细胞分辨率证明持续转录对于维持早期胚胎中大部分基因的启动子处于开放状态是必需的，染色质状态开放和转录活动互相促进，共同维持合子基因的稳定表达（图3）。

图3：转录对染色质开放状态的维持以及转录因子对染色质开放区域的调控作用

（4）研究发现多能性核心因子Oct4的靶基因结合位点在4-细胞阶段就处于开放状态，远早于真正建立多能性的囊胚期，暗示这些位点作为潜在的顺式调控元件可能参与了早期胚胎细胞的命运决定过程。

（5）首次在单个细胞内对父母源基因组的染色质状态以及DNA甲基化进行了深入分析。研究发现，受精后染色质状态和DNA甲基化进行了不同步的重编程过程，父母源基因组的染色质状态快速重编程、在每个单细胞中迅速达到精确平衡并一直维持。而DNA甲基化的重编程要慢一些并在父母源基因组之间维持不对称分布（图4）。

图4：小鼠着床前胚胎发育过程中父母源基因组DNA甲基化的不对称分布

（6）首次在单细胞分辨率解析了雌性胚胎细胞中父母源X染色体的DNA甲基化和染色质状态重编程过程的异同。研究发现受精后，在雌性胚胎中失活的父源X染色体其DNA甲基化重编程速度要明显慢于活跃的母源X染色体，二者之间DNA甲基化的差异一直到囊胚晚期才逐渐消除；而雌性胚胎中父母源X染色体同步进行快速的染色质状态重编程，并在整个植入前时期维持这一父母源X染色体之间染色质状态的精确平衡（图5）。

图5：小鼠着床前雌性胚胎单个细胞中父母源X染色体的DNA甲基化和染色质状态的动态变化

（7）首次在单细胞分辨率揭示了小鼠植入前胚胎发育过程中表观基因组的异质性。受精后，启动子区域DNA甲基化异质性强烈的基因和染色质状态异质性强烈的基因分别是两类不同的基因。这暗示在小鼠着床前胚胎发育的过程中，染色质状态异质性和DNA甲基化异质性可能分别受不同机制的调控。

（8）首次在单细胞分辨率将细胞周期与染色质状态联系了起来，准确推断出每个单细胞的倍性和细胞周期阶段，并发现小鼠着床前胚胎在体内发育过程中和胚胎干细胞使用了基本相同的一组DNA复制起始位点。

图6: 小鼠着床前胚胎DNA甲基化和染色质重塑特征示意图

该研究系统地描绘了高度特化的配子在受精后重编程到具有发育全能性的受精卵、以及进一步发育成多能性胚胎的过程中，DNA甲基化和染色质状态发生的精准、有序的变化，各个组学层面之间的互动关系，以及父母源基因组在着床前胚胎发育中DNA甲基化和染色质状态的重编程过程（图6）。该工作为今后人们继续研究哺乳动物早期胚胎细胞全能性和多能性的开启奠定了基础，同时为体细胞克隆效率的提高以及早期胚胎发育异常的诊断与治疗提供了新思路。

北京大学生命科学学院BIOPIC中心的博士后郭帆博士（现为四川大学研究员）、博士生李琳、李静云为该论文的并列第一作者；北京大学生命科学学院汤富酬研究员和四川大学郭帆研究员为这篇文章的共同通讯作者。该研究工作由北京大学和四川大学共同合作完成，并且得到了国家自然科学基金委员会、北京未来基因诊断高精尖创新中心，以及北大-清华联合中心的资助。

原文链接：

https://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201782a.html